[64Cu]Cuによるアテローム性動脈硬化のイメージング

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9249 (2023) この記事を引用

メトリクスの詳細

アテローム性動脈硬化症は、心血管イベントを引き起こす可能性がある太い動脈の慢性炎症性疾患です。心血管イベントのリスクが最も高い患者を特定することは困難ですが、陽電子放出断層撮影法 (PET) を使用した分子イメージングが役立つ可能性があります。この研究の目的は、3 つの異なる PET トレーサーを評価し、直接比較することでした。さらに、トレーサーの取り込みを動脈血管壁の遺伝子発現の変化と比較します。研究には雄のニュージーランド白ウサギ (対照群; n = 10、アテローム性動脈硬化症群; n = 11) を使用しました。血管壁の取り込みは、PET/コンピューター断層撮影 (CT) を使用して、[18F]FDG (炎症)、Na[18F]F (微小石灰化)、および [64Cu]Cu-DOTA-TATE (マクロファージ) の 3 つの異なる PET トレーサーで評価されました。。トレーサーの取り込みは標準化取り込み値 (SUV) として測定され、両グループの動脈はオートラジオグラフィー、qPCR、組織学、および免疫組織化学によって ex vivo で分析されました。ウサギでは、アテローム性動脈硬化症群は、対照群と比較して、3 つのトレーサーすべての有意に高い取り込みを示しました。[18F]FDG: SUV 平均 1.50 ± 0.11 対 1.23 ± 0.09、p = 0.025。 Na[18F]F: SUV 平均 1.54 ± 0.06 対 1.18 ± 0.10、p = 0.006; [64Cu]Cu-DOTA-TATE: SUV 平均 2.30 ± 0.27 対 1.65 ± 0.16。 p = 0.047。分析された102個の遺伝子のうち、52個は対照群と比較してアテローム性動脈硬化症群で差次的に発現され、いくつかの遺伝子はトレーサーの取り込みと相関していた。結論として、ウサギのアテローム性動脈硬化症を特定するための [64Cu]Cu-DOTA-TATE と Na[18F]F の診断的価値を実証しました。 2 つの PET トレーサーは、[18F]FDG で得られたものとは異なる情報を提供しました。 3 つのトレーサーはいずれも互いに有意な相関はありませんでしたが、[64Cu]Cu-DOTA-TATE と Na[18F]F の取り込みは両方とも炎症マーカーと相関しました。 [64Cu]Cu-DOTA-TATEは、[18F]FDGおよびNa[18F]Fと比較して、アテローム性動脈硬化症ウサギにおいて高かった。

アテローム性動脈硬化症は、脂質と繊維要素の蓄積を特徴とする動脈血管壁の慢性炎症性疾患です1。心血管疾患の罹患率と死亡率の主な原因の 1 つとして、より優れた治療法と最適化された診断ツールが求められています。

やがて、アテローム性動脈硬化は脆弱性プラークへと進行し、最終的にプラークの破裂につながる可能性があります2,3。脆弱性プラークは、プラーク内出血、炎症性細胞浸潤、脈管血管の新生血管形成、および薄い線維性キャップの発達によって特徴付けられます4。アテローム性動脈硬化が進行すると、石灰化が起こります。アテローム性動脈硬化の進行に関与する炎症プロセスは、アテローム性動脈硬化を視覚化して治療するための重要なターゲットです。

機能的特徴付けと治療モニタリングには、非侵襲的な分子イメージングモダリティが非常に役立ちます。分子イメージングは、特定の細胞成分または代謝経路を視覚化することに特化しています。陽電子放射断層撮影法 (PET) は、さまざまな分子プロセスに関する貴重な情報を提供します5。臨床現場で最も一般的に使用される PET トレーサーは、2-[18F]フルオロ-2-デオキシ-D-グルコース ([18F]FDG)6 です。それは、炎症プラークに見られる血管マクロファージなどの代謝的に活性な細胞に蓄積します。 [18F]FDG は、アテローム性動脈硬化症における炎症の定量化と追跡の両方に役立ちます 7、8、9、10、11。残念なことに、心筋細胞による [18F]FDG の生理学的取り込みは、冠状動脈の炎症の視覚化に課題をもたらしています 12。これらの制限は、心筋への取り込みが低い他の PET トレーサーを使用することで解消できます。 PET トレーサー [64Cu]Cu-DOTA-TATE は、活性化されたマクロファージの表面上のソマトスタチン受容体 2 (SSTR2) 発現を検出します。したがって、血管炎症の評価に有用であることが証明されています13、14、15。別の PET トレーサーである Na[18F]F は、初期の血管壁の微小石灰化の特性評価に使用されています 16、17、18。 Na[18F]F の取り込みは、心血管疾患の増加した患者のリスク層別化における非侵襲性バイオマーカーとして機能する可能性があることが示唆されています 19。 3 つの PET トレーサーは個別に調査されました。しかし、トレーサーの直接比較や、血管壁の根底にある遺伝子発現変化との相関関係は、我々の知る限りでは行われていない。

この研究では、ウサギモデルにおけるアテローム性動脈硬化プロセスの主要な分子構成要素を評価し、特徴付けることを目的としました。炎症と微小石灰化を標的とする 3 つの PET トレーサーが使用され、PET の取り込みと動脈血管壁における遺伝子発現の変化が比較されました。

すべての動物実験は、デンマーク法務省の動物研究委員会からの適切な承認（ライセンス番号：2016-15-0201-00831）に従って実施され、研究はARRIVEおよびAVMAガイドラインに従って実施されました。すべての方法は、関連するガイドラインおよび規制に従って実行されました。

21 匹の雄 SPF ニュージーランド白ウサギ (11 週齢) を無作為に対照群 (n = 10) とアテローム性動脈硬化症群 (n = 11) に割り付けました (KB Lidköping Kaninfarm、スウェーデン)。ウサギは単独飼育であった。アテローム性動脈硬化症は、食事と腹部および胸部大動脈の露出の組み合わせによって誘発されました。アテローム性動脈硬化症のグループには、最初の手術の 2 週間前に、コレステロール 0.30% を含む高コレステロール食 (HCD) が与えられました。 8 週間と再採掘試験期間の後、ウサギを 0.15% HCD に切り替えました。対照群には通常の固形飼料を与えました（研究概要図 1 を参照）。

対照群とアテローム性動脈硬化症群の一般的な特徴。アテローム性動脈硬化症グループに対する食事療法（コレステロール0.30％とコレステロール0.15％を含む高コレステロール食）と外科的介入の両方を含む研究概要と、両グループのスキャン時間。 T0 = 研究開始、最初の外科的介入の 2 週間後 (T2)、および 2 回目の外科的介入の開始から 5 週間後 (T5)。 8 週間後 (T8)、食餌を 0.30% HCD から 0.15% HCD に切り替えました。研究はさらに 16 週間継続され、20 週間後 (T20) にウサギの PET/CT スキャンとそれに続く ex vivo 分析によって研究が完了しました。

無菌条件下で、アテローム性動脈硬化症グループは、まず四肢の 1 つに大腿動脈を局在化させることによって露出を受けました。次に、4F-Fogarty 塞栓除去カテーテルを動脈に導入してから、バルーンを約 20 cm 前進させます。血管損傷を確実にするために、バルーンを膨張させ、収縮させることを 3 回繰り返すという反復動作を実行しました。最後に、筋肉層と皮膚をそれぞれ吸収性縫合糸と非吸収性縫合糸で閉じました。この手順を 3 週間後に反対側の四肢にも繰り返しました。感染予防のため、手術前にエンロフロキサシン (15 mg/kg) を筋肉内注射しました。

術後ケアは、鎮痛剤ブプレノルフィン (0.01 ～ 0.05 mg/kg、皮下注射 (sc)) とケトプロフェン (3 mg/kg、筋肉内注射 (im)) の併用で構成され、手術当日に投与されました。

ウサギの安楽死は、安楽死に関する AVMA ガイドラインに従って、ケタミン (35 mg/kg) およびキシラジン (5 mg/kg) の筋肉内注射による最初の鎮静、その後の致死量のペノバルビタール (140 mg/kg) の静脈内注射でした。動物。

すべてのウサギ (n = 21) を、トレーサー [18F]FDG を使用して小動物専用 PET/コンピュータ断層撮影 (CT) システム (Inveon、Siemens Medical Systems、ペンシルベニア州、米国) でベースラインスキャンした後、ウサギをランダムに次のグループに分けました。 2つのグループ。スキャンは、腹部大動脈をカバーするワンベッドポジションスキャンとして実行されました。スキャンはアテローム性動脈硬化症グループの手術の 3 週間前と手術の 20 週間後に実施され、最終スキャンは異なるトレーサーを使用して両グループで実施されました：（1）[18F]FDG、（2）Na[18F]F、および（ 3) [64Cu]Cu-DOTA-TATE。 3 つのトレーサーはすべて、PET イメージングの前に 60 分間循環し、取得時間は 1200 秒でした。各トレーサーの放射線量は、123.4 ± 15.6 MBq ([18F]FDG)、116.0 ± 10.2 MBq (Na[18F]F)、および 84.41 ± 5.78 MBq ([64Cu]Cu-DOTA-TATE) でした。両グループの 3 つすべてのトレーサーの ex vivo オートラジオグラフィーを確実にするために、3 つのスキャンをランダムな順序で実行しました。トレーサーの物理的減衰を可能にするために、18F 標識化合物によるトレーサー注入後少なくとも 24 時間 (18F の物理的半減期: 110 分)、および [64Cu]Cu-DOTA-TATE 注入後 72 時間 (物理的半減期) の間隔を置きます。・64Cuの寿命：12.7時間）を確保しました。

画像は、Inveon Research Workspace 4.2 ソフトウェア (Siemens Medical Systems、ペンシルベニア州、米国) を使用して、腹部大動脈上に腸骨分岐部から右腎動脈までの円形の関心領域 (ROI) を描くことにより、融合 PET/CT 画像として分析されました。 3番目のスライド。 ROI は CT 画像の軸面に描画され、位置合わせされた PET 画像に重ねられました。大動脈上に描画されたすべての ROI、関心ボリューム (VOI) から 1 つのボリュームシリンダーが作成されました。平均標準化取り込み値（SUVmean）は、VOI におけるトレーサー取り込みを減衰補正された注入活性で割ったもの、およびウサギの体重で割ったものとして計算されました。結果は、遺伝子発現結果との最良の比較のために、大動脈セグメント全体の平均 SUV (SUVmean) として報告されます。トレーサー対バックグラウンド比 (TBR) は、動脈内の [18F]FDG 取り込みを血液プールの静脈からの [18F]FDG 取り込みで割ったものとして得られます。

最後のスキャンの直後にウサギを安楽死させ、特定の ex vivo 分析のために大動脈のセグメントを選択しました。オートラジオグラフィーは、大動脈弓と下行胸部大動脈の半分を含む 3 つのトレーサーすべてに対して実行されました (各トレーサーにつき n = 4)。大動脈の胸部がオートラジオグラフィーの対象として選択されたのは、カセッテ内での露光中に組織が圧迫されるためであり、PET/CT イメージングが実行された腹部の形態を保存したいと考えたからです。

腸骨分岐部より上の腹部大動脈の下部が RNA 抽出のために選択されました。

胸部、腹部大動脈の残りの部分、および大動脈弓を 4% ホルマリンで 24 時間固定した後、2 ～ 3 mm の断片に切片にしてパラフィンに包埋しました。一連の軸方向切片 (厚さ 4 μm) が得られ、組織学および免疫組織化学 (IHC) のために選択されました。

一般的な形態学的特徴付けのために、ヘマトキシリン & エオシン (H&E) 染色が実行され、石灰化についてはフォンコッサ染色が実行されました。

IHC では、マクロファージ浸潤を評価するために RAM 11 (モノクローナルマウス抗ウサギマクロファージ、クローン RAM11、Agilent DAKO、米国) を使用しました。 Envision FLEX DAB + Substrate Chromogen System (Agilent、DAKO、米国) を対比染色としてのヘマトキシリンとともに免疫反応性を明らかにするために使用しました。

大動脈は抽出直後、RNAlater Stabilization Solution (ThermoFisher、MA、USA) に 5 °C で 24 時間保存した後、溶液から取り出し、さらに使用するまで -80 °C で保存しました。すべての試薬とキットは QIAGEN (ドイツ、ヒルデン) から購入しました。全 RNA を TRIzol® 試薬で抽出し、RT2 First Strand Kit を使用して cDNA に逆転写しました。ウサギ創傷治癒アレイ (QIAGEN、PANZ-121ZA-RT2 プロファイラー PCR アレイ) とカスタムアレイ (QIAGEN、CLAN32799A - カスタム RT2 PCR アレイ) の 2 つの異なるアレイを使用しました。プレートは、Mx3000P リアルタイム PCR システム (Stratagene、カリフォルニア州、米国) で読み取られました。結果はオンラインソフトウェア GeneGlobe (QIAGEN) を使用して分析されました。目的の遺伝子（GOI）の遺伝子発現レベルを、参照遺伝子 ACTA2、ACTB、GAPDH、LDHA、およびオクタマー結合様ドメインを含む非 POU ドメイン（LOC100346936）のレベルに対して正規化しました。データは 2-deltaCt 法を使用して分析されました。

インビボデータの統計分析は、GraphPad Prism バージョン 8 (GraphPad Software Inc.、米国) で得られました。

対応のない両側 t 検定を実行して、異なる時点でのグループ間のトレーサー取り込みを比較し、遺伝子の制御倍数を比較しました。遺伝子発現レベルとトレーサーの間の相関関係は、ピアソン相関を使用して分析されました。 0.05 未満の P 値は有意であるとみなされました。

すべてのデータは、平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として表示されます。

アテローム性動脈硬化症群と対照群間の特徴的な違いは、分子イメージング、組織学、IHC、および遺伝子発現解析によって評価されました。

ベースラインで、[18F]FDG PET/CT スキャンでは、対照群とアテローム性動脈硬化症群の間で取り込みに差がないことが明らかになりました (SUV 平均 1.13 ± 0.07 対 SUV 平均 1.04 ± 0.088; p = 0.9)。アテローム性動脈硬化症群では [18F]FDG がベースラインから終了まで有意に増加しましたが (p = 0.005)、年齢が一致した対照群では 20 週間の研究期間中にわずかで有意ではない増加のみが観察されました (p = 0.389)(図２Ｄ）。動脈におけるアテローム性動脈硬化の発生に関する一般的な特徴は、組織学によって確立されました (図 2F)。

[18F]FDG in vivo PET/CTイメージングおよびex vivo解析。 (A) [18F]FDG を取り込んだ対照ウサギの冠状面の CT、PET、および融合 PET/CT 画像。対照ウサギは、[18F]FDG の均一な取り込みを示します (PET および PET/CT 画像上の動脈を示す赤い矢印)。 (B) アテローム性動脈硬化症ウサギにおける [18F]FDG 取り込みの冠状面の CT、PET、および融合 PET/CT 画像。赤い矢印でマークされた PET および PET/CT 画像の両方で、腹部動脈全体の取り込みが明確に視覚化されています。カラーバーは SUV で調整され、背景は減算されません。カラーバーは 2 つのグループで同一です。 (C) ドットプロットは、[18F]FDG のベースラインおよびターミナルスキャンからの in vivo SUV 平均値 ± SEM を示します。ベースラインスキャンでは、グループ間で有意な (ns) 差は示されません。対照群 (n = 10) では、ベースラインから最終スキャンまで有意差が見られませんでしたが、アテローム性動脈硬化症群 (n = 11) では、[18F]FDG 取り込み (**) に有意差がありました (p = 0.0029)。最終スキャンでは、アテローム性動脈硬化症群と対照群の間で [18F]FDG 取り込みに有意 (*) 差があることが明らかになりました (SUV 平均 1.50 ± 0.112 対 SUV 平均 1.23 ± 0.089、p = 0.025)。 (D) 両グループの各ウサギのベースラインから研究終了までの [18F]FDG 取り込みの変化を示すスパゲッティプロット。 (E) オートラジオグラフィー画像は、対照およびアテローム性動脈硬化症動脈の大動脈弓および下行胸動脈における [18 F] FDG の結合を示しています。 (F) 腹部動脈および大動脈弓の断面 H&E 染色。アテローム性動脈硬化症の動脈は壁の肥厚とプラークの形成を示し、正常な動脈の内腔と比較して動脈の内腔が狭くなります。大動脈弓は、アテローム性動脈硬化症を伴う腹部動脈と同様の形態学的変化を示します。

研究終了時に、CT、PET、および融合PET/CT画像で見られた[18F]FDGの取り込みは、対照群と比較してアテローム性動脈硬化症群で明らかに高かった(図2A、B)。対照群と比較して、アテローム性動脈硬化症群では [18F]FDG の有意に高い取り込みが観察されました (SUV 平均 1.50 ± 0.112 対 1.23 ± 0.089; p = 0.025; 図 2C、D)。アテローム性動脈硬化症グループの TBRmean は 1.11 ± 0.1、TBRmax は 2.20 ± 0.1 でしたが、対照グループの TBRmean は 0.99 ± 0.1、TBRmax は 2.14 ± 0.1 でした。

オートラジオグラフィーにより、アテローム性動脈硬化症群の大動脈弓では、[18F]FDG のより高い蓄積も観察されました (図 2E)。 H&E により、アテローム性動脈硬化症の動脈に泡沫細胞の蓄積、コレステロール結晶、および狭窄した内腔が見つかりました。対照グループは、薄くて無傷な動脈壁を示しました (図 2F)。

動脈血管壁内の微小石灰化を評価するために、ウサギを Na[18F]F PET/CT でスキャンしました (図 3A、B)。アテローム性動脈硬化症群と対照群との間では、摂取量の有意差が観察された（SUV平均 1.54 ± 0.057 対 SUV平均 1.18 ± 0.099; p = 0.006; 図 3C）。オートラジオグラフィーにより、アテローム性動脈硬化症群においてNa[18F]Fの不均一かつ高蓄積が観察され(図3D)、PET所見が確認された。プラーク内の微小石灰化の存在と位置は、Von Kossa 染色によっても示されます (図 3E)。

[18F]NaF in vivo PET/CTイメージングおよびex vivo分析。 (A) 対照ウサギの冠状面の CT、PET、および融合 PET/CT 画像。対照ウサギは、PET および PET/CT 上で赤い矢印でマークされた [18F]NaF の均一な取り込みを示します。 (B) アテローム性動脈硬化症のウサギの CT、PET、および融合 PET/CT 画像は、[18F]NaF のより高い取り込みを示しました。 [18F]NaF は、腹部動脈の石灰化病変において特異的に高い取り込みを示しました。これは、各画像の赤い矢印でマークされた CT、PET、および PET/CT で見ることができます。カラーバーは、バックグラウンドを減算せずに SUV でキャリブレーションされます。両方の画像で同じスケールバーが使用されています。 (C) 対照群およびアテローム性動脈硬化症群の末端 [18F]NaF スキャンの SUV 平均値 ± SEM をドットプロットで示します。アテローム性動脈硬化症群は、対照群と比較して有意に高い摂取量を示しました（SUV平均 1.54 ± 0.057 対 SUV平均 1.18 ± 0.099、p = 0.006）。 (D) 蛍光オートラジオグラフィー画像は、対照およびアテローム性動脈硬化症動脈の大動脈弓および下行胸動脈における [18 F] NaF の結合を示しています。 (E) Von Kossa で染色した腹部動脈の断面図。対照動脈のいずれもフォン・コッサに対して陽性に染色されなかったため、カルシウム沈着は明らかではなかった。アテローム性動脈硬化症の腹部動脈と大動脈弓のフォンコッサ染色では、カルシウムの沈着が見られます (黒色)。

他の 2 つのトレーサーの結果と一致して、[64Cu]Cu-DOTA-TATE の取り込みが、対照群と比較してアテローム性動脈硬化症群で有意に高いことがわかりました (SUV 平均 2.30 ± 0.266 対 SUV 平均 1.65 ± 0.157; p = 0.047)。これは PET および PET/CT 画像でも観察されました (図 4A ～ C)。アテローム性動脈硬化症群の動脈における [64Cu]Cu-DOTA-TATE の蓄積はオートラジオグラフィーによって確認されました (図 4D)。プラーク内の豊富なマクロファージ浸潤は、RAM11 染色から明らかでした。対照動脈では、マクロファージの存在は観察されず（図４Ｅ）、ＰＥＴおよびオートラジオグラフィーで観察された取り込みの低さが確認された。

[64Cu]Cu-DOTA-TATE PET/CT イメージングと ex vivo 分析。 (A) [64Cu]Cu-DOTA-TATE を摂取した対照ウサギの冠状面の CT、PET、および融合 PET/CT 画像。動脈には赤い矢印が付いています。 (B) [64Cu]Cu-DOTA-TATE を取り込んだアテローム性動脈硬化症ウサギの CT、PET、および融合 PET/CT 画像は、両方の画像で赤い矢印でマークされた動脈での高い均一な取り込みを示しました。カラーバーは、バックグラウンドを差し引かずに SUV でキャリブレーションされました。両方の画像に同じスケールバーが使用されています。 (C) ドットプロットは、[64Cu]Cu-DOTA-TATE のターミナルスキャンの in vivo SUV 平均値 ± SEM を示しました。ドットプロットは、アテローム性動脈硬化症群と対照群の間の[64Cu]Cu-DOTA-TATE取り込みにおける有意(*)差を示しました(SUV平均2.30±0.266対SUV平均1.65±0.157、p=0.047)。 (D) オートラジオグラフィー画像は、対照およびアテローム性動脈硬化症動脈の大動脈弓および下行大動脈における [64Cu]Cu-DOTA-TATE の結合を示しています。 [64Cu]Cu-DOTA-TATE の結合は、対照動脈よりもアテローム性動脈硬化症の動脈で高かった。 (E) 腹部動脈の断面図。動脈をパラフィンに包埋し、IHCを実施した。抗ウサギマクロファージ (RAM11) 染色では、アテローム性動脈硬化症の動脈の腹部と大動脈弓の両方のプラーク内のコレステロール結晶を取り囲むマクロファージが示されています。

3 つのトレーサーを直接比較すると、[64Cu]Cu-DOTA-TATE トレーサーはアテローム性動脈硬化症グループで最も高い絶対摂取量を示し (図 5A、B)、アテローム性動脈硬化症グループとコントロールの間で最も大きな差が見られました。 [18F]FDG (比 SUVmean = 1.22) および Na[18F]F (比 SUVmean = 1.30) と比較したグループ (比 SUVmean = 1.38)。アテローム性動脈硬化症グループの 3 つのトレーサーのペアワイズ分析により、[18F]FDG と比較して [64Cu]Cu-DOTA-TATE の摂取量が有意に高いことが明らかになりました (SUVmean: 2.29 vs 1.50、p = 0.0012 および SUVmax: 9.86 vs 6.59、p < 0.0001) ）およびNa[18F]Fと比較した場合（SUVmean：2.29 vs 1.55、p = 0.0027およびSUVmax：9.86 vs 5.79、p < 0.0001）。対照群のNa[18F]F摂取量は、SUVmaxとして評価した場合、[18F]FDGおよび[64Cu]Cu-DOTA-TATEの両方よりも有意に低かった(それぞれ4.27対6.75(p=0.0019)および8.32(p<0.0001))。一方、SUVmean として評価した場合、対照グループの 3 つのトレーサーのいずれにも有意差は見つかりませんでした。

3 つの PET トレーサーと対応する PET/CT 画像の直接比較。 (A) SUVmean および (B) SUVmax について、Na[18F] と比較して [64Cu]Cu-DOTA-TATE および [18F]FDG と比較して [64Cu]Cu-DOTA-TATE の取り込みが有意に高い 3 つのトレーサーのグループ化比較。 (C) [18F]FDG と Na[18F]F、(D) [18F]FDG と [64Cu]Cu-DOTA-TATE、(E) Na[18F]F と [64Cu]Cu-DOTA の相関プロット-タテ。 (F) アテローム性動脈硬化症の動脈の [18F]FDG PET/CT (赤い矢印)。 (G) 同じ病変における Na[18F]F PET/CT (赤い矢印) および (H) 同じ領域における [64Cu]Cu-DOTA-TATE の取り込み (赤い矢印)。

ピアソン相関分析によると、[18F]FDG と Na[18F]F の間のアテローム性動脈硬化症グループでは、r = 0.381 (p = 0.278) (図 5C)、r = -0.227 (p = 0.529) と、どのトレーサーも有意な相関はありませんでした。 ) [18F]FDG と [64Cu]Cu-DOTA-TATE の間のアテローム性動脈硬化症グループの場合 (図 5D)、Na[18F]F と [64Cu]Cu-DOTA- の間のアテローム性動脈硬化症グループの場合は r = 0.503 (p = 0.138)タテ（図５Ｅ）。アテローム性動脈硬化症ウサギの腹部大動脈のトレーサー蓄積の違いを図 5F ～ H に示します。

クラスターグラム分析により、アテローム性動脈硬化症ウサギを対照ウサギから分離し、差次的に発現される遺伝子を有する２つのクラスターを同定した（図６）。分析した 102 個の GOI のうち、34 個の GOI が対照群と比較してアテローム性動脈硬化症群で有意に上方制御され、18 個の GOI が対照群と比較してアテローム性動脈硬化症群で有意に下方制御されました。一般に、細胞表面受容体、細胞外マトリックスのリモデリング、炎症性サイトカインおよびケモカインに関連する遺伝子は上方制御され、一方下方制御された遺伝子は細胞接着および血管壁アテローム発生効果に関連していました（GeneGlobe、QIAGEN）。 2 つのグループに関係なく、最も差次的に発現した遺伝子が 3 つの PET トレーサーとの相関分析で考慮されました (表 1)。

対照群とアテローム性動脈硬化症群の遺伝子発現。対照群とアテローム性動脈硬化症群の遺伝子発現を示すクラスターグラム。各グループは、他のグループと比較して、高度に発現された遺伝子の特定のクラスターを示します。

分析された遺伝子のいくつかは、[18F]FDG の取り込みと相関していました。ただし、ほとんどの相関関係は Na[18F]F と [64Cu]Cu-DOTA-TATE で見つかりました (表 1)。

カテプシン K (CTSK) は、対照群と比較してアテローム性動脈硬化症群で 5.40 倍の上方制御 (p < 0.00001) を示し、Na[18F]F (r = 0.49、p = 0.0409) および [64Cu]Cu の両方と正の相関を示しました。 -DOTA-TATE (r = 0.50、p = 0.0332) (表 1 を参照)。マクロファージマーカーである CD86 にも同じ傾向が見られ、アテローム性動脈硬化症群では対照群と比較して 78 倍の上方制御が示されました (p < 0.00001) (表 2 を参照)。アテローム性動脈硬化症群では、対照群と比較してインテグリンアルファ L (ITGAL) の 235 倍の上方制御が見られ、Na[18F]F (r = 0.54、p = 0.0113) および [64Cu]Cu- DOTA-TATE (r = 0.47、p = 0.0321)。

この研究では、ウサギモデルでアテローム性動脈硬化を評価するための [64Cu]Cu-DOTA-TATE の有用性を実証しました。われわれは、PET/CT とオートラジオグラフィーによって、[64Cu]Cu-DOTA-TATE、[18F]FDG、および Na[18F]F がアテローム性動脈硬化プラークに蓄積することを示しました。我々の画像結果は、動脈血管壁の顕著な形態的変化およびアテローム性動脈硬化性動脈におけるアテローム生成促進性分子マーカーの上方制御という我々の所見を裏付けるものである。

[18F]FDG は、細胞内の代謝活動を視覚化できるため、アテローム性動脈硬化症の PET イメージングに使用される一般的なトレーサーです 14。 [18F]FDG の取り込みは、マクロファージの分化、細胞の活性化、および細胞のグルコース代謝と関連しています 5,20,21。しかし、健康な心筋では[18F]FDGの取り込みが多く、したがって流出が起こるため、冠状動脈での使用は制限されます。

[64Cu]Cu-DOTA-TATE は SSTR2 を発現する細胞を特異的に標的とします。 SSTR2 は活性化されたマクロファージの表面で、アテローム性動脈硬化プラークで高レベルで見つかっているため、健康な心筋では取り込みが少なく、マクロファージでは [64Cu]Cu-DOTA-TATE の取り込みが多いため、[18F]FDG の魅力的な代替品となります。現在の研究では、[18F]FDG と Na[18F]F の両方と比較して、[64Cu]Cu-DOTA-TATE の取り込みが有意に高いこともわかりました。 [18F]FDG と [64Cu]Cu-DOTA-TATE はどちらも炎症を標的としていますが、調査した 3 つのトレーサーのいずれについてもトレーサー摂取間の相関関係を見つけることができず、各トレーサーによって得られる個別の情報を示していました。

いくつかの臨床研究では、患者のアテローム性動脈硬化症の負担を評価する際に [68Ga]Ga-DOTA-TATE を使用して成功したことが報告されています 14、22、23。本研究では、[64Cu]Cu-DOTA-TATEを使用しました。これは同じターゲットに結合しますが、[68Ga]と比較して[64Cu]の陽電子範囲が4倍低いためです（約1 mm対4 mm）。 [64Cu] は、血管壁として小さな構造を評価する場合に、特定の値のより優れた空間分解能を提供します。我々は以前、血管イメージングにおいて[68Ga]と比較して[64Cu]の有益な効果が、より高い取り込みと心血管危険因子とのより良い相関を示したことを実証した24。現在の研究では、[68Ga]Ga-DOTA-TATE が使用された同じモデルでの最近の研究と比較して、[64Cu]Cu-DOTA-TATE の取り込みが高いことがわかりました 12。

プラークの炎症に続いて、骨形成の分化により、ミネラルの代謝活性によって微小石灰化の発達が引き起こされます。微小石灰化は、アテローム性動脈硬化のより不安定な段階のマーカーであり、プラークを取り囲む線維性キャップの不安定化によって引き起こされるプラークの破裂につながる可能性があります 25。 CT26 では検出できない微小石灰化とは異なり、巨視的石灰化は後期の CT で検出できます。初期の微小石灰化における Na[18F]F の取り込みは、アテローム性動脈硬化性プラークの治癒反応と相関しています。したがって、Na[18F]F は炎症や高リスクのプラークと関連しています 27。この研究では、アテローム性動脈硬化症の動脈は、年齢が一致した対照と比較して有意に高い Na[18F]F の取り込みを示し、これはおそらく代謝的に活発な石灰化を示していると考えられます。図 3B は、Na[18F]F の取り込みが多い特定の病変を示しており、微小石灰化およびアテローム性動脈硬化の存在が確認されていますが、アテローム性動脈硬化症ウサギの CT スキャンでは石灰化は明らかではありませんでした。 PET/CT 所見を組織学および IHC で検証しました。染色により、泡沫細胞およびコレステロール結晶の周囲のマクロファージの浸潤、および微小石灰化の存在が確認されました。胸部大動脈からのオートラジオグラフィー所見も組織学および IHC によって確認され、大動脈の腹部と胸部の間でアテローム性動脈硬化負荷の顕著な差は見つかりませんでした。

アテローム性動脈硬化症の動脈と対照動脈の遺伝子発現を比較すると、さまざまな経路を通じてアテローム性動脈硬化に関連する遺伝子が上方制御されていることが明らかになりました。この研究で使用した 3 つのトレーサーとの相関分析のために、最も上方制御された遺伝子が選択されました。 [18F]FDG と相関する遺伝子はわずかでしたが、[64Cu]-Cu-DOTA-TATE および Na[18F]F 蓄積と相関する遺伝子もいくつかありました。これまでに、CTSK はヒトの頸動脈プラークにおける FDG の取り込みと関連しており、[64Cu]-Cu-DOTA-TATE の取り込みとは関連していないことが判明しています 28。対照的に、我々の調査結果は、CTSK と [64Cu]-Cu-DOTA-TATE および Na[18F]F の間に正の相関があることを示していますが、[18F]FDG とは相関がありません。我々は、[64Cu]-Cu-DOTA-TATE が CD86 との正の相関によりマクロファージ浸潤と相関することを確認しましたが、我々のグループが以前に発見したような活性化マクロファージのマーカー CD163 との相関は見つかりませんでした 15。マクロファージマーカー CD36、CD86、CD163 と Na[18F]F の間に正の相関関係が見つかり、Na[18F]F 活性が微小石灰化だけでなくマクロファージ浸潤とも相関することが示されました 29。

TNF は活性化された M1 マクロファージ関連サイトカインであり、全身性炎症に関与します。私たちの研究では、TNF が [18F]FDG および Na[18F]F の両方と正の相関があることを発見しました。これらの結果は、TNF と [18F]FDG30 の間の炎症性アテローム性動脈硬化プラークにおける正の相関関係を発見した以前の研究と一致しています。

IL-10 は、マクロファージの調節を不活化する特性を持つ抗炎症性サイトカインで、アテローム性動脈硬化を防ぎます。アテローム性動脈硬化症グループでは 14 倍上方制御され、[64Cu]-Cu-DOTA-TATE と正の相関がありました。アテローム性動脈硬化の進行の予測因子である ITGAL も、[64Cu]-Cu-DOTA-TATE および Na[18F]F の両方と相関することが判明しました。調査されたすべての遺伝子の中で、ITGAL はアテローム性動脈硬化症グループと対照グループの間で最も異なって発現されました。 ITGAL 発現は炎症性単球のサインであり、他の免疫細胞とともに蓄積してアテローム性動脈硬化プラークとなります 31,32。

遺伝子発現は体外で行われ、侵襲的なアプローチが必要です。 PET/CT による分子イメージングは、非侵襲的なアプローチを提供します。さらに、病気の進行を追跡するために、PET/CT スキャンをさまざまな時点で実行できます。

ウサギモデルの限界は、不安定プラークや心血管イベントへの疾患の進行がないことです。このモデルでは、プラーク内出血、プラーク破裂、梗塞はほとんど見られません。もう1つの制限は、研究に雄ウサギのみを使用することです。ただし、これはメスのウサギにおけるホルモン変化の潜在的な影響を回避するために選択されました。 [64Cu]Cu-DOTA-TATE と Na[18F]F の両方がプラークの脆弱性を予測することを確認するには、将来の前向き臨床試験が必要です。

我々は、アテローム性動脈硬化の評価における [64Cu]Cu-DOTA-TATE と Na[18F]F の価値を実証しました。得られた結果は、[18F]FDG で得られた結果とは異なり、3 つのトレーサー間に有意な相関は見つかりませんでした。 [64Cu]Cu-DOTA-TATEの取り込みは、[18F]FDGおよびNa[18F]Fの両方と比較して、アテローム性動脈硬化症ウサギにおいて有意に高かった。 CD36、CD86、ITGALなどの主要な炎症性バイオマーカーはアテローム性動脈硬化症ウサギで上方制御され、[64Cu]Cu-DOTA-TATEおよびNa[18F]Fのトレーサー蓄積と相関したが、[18F]FDGとは相関しなかった。

現在の研究中に生成および分析されたデータセットは、GEO リポジトリ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE220754 で入手できます。

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このプロジェクトは、欧州連合の Horizon 2020 研究およびイノベーションプログラムから助成金契約第 2 号に基づいて資金提供を受けました。 670261 (ERC Advanced Grant) および 668532 (Click-It)、ルンドベック財団、ノボノルディスク財団、デンマークイノベーションファンド、デンマーク癌協会、アービッドニルソン財団、ネイ財団、リグショスピタレット研究財団、デンマーク国立研究財団（助成金 126）—PERSIMUNE、デンマーク首都地域研究評議会、デンマーク保健当局、ジョン・アンド・バーセ・マイヤー財団および独立研究研究評議会。アンドレアス・ケアーはルンドベック財団の教授です。

コペンハーゲン大学病院リグショスピタレット臨床生理学、核医学および PET および分子イメージングクラスター & コペンハーゲン大学生物医科学部、Blegdamsvej 9, 2100, Copenhagen, Denmark

コンスタンス・E・グランジャン、スーン・F・ペデルセン、カミラ・クリステンセン、アルテア・ディベネデット、ティナ・ビンダップ、アンドレアス・ケアー

コペンハーゲン大学、獣医臨床動物科学部、コペンハーゲン、デンマーク

トーマス・エリクセン

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CEG: 調査、方法論、データ収集、形式的分析、執筆—原案、執筆—レビューおよび編集、SFP: 調査、概念化、データ収集、執筆—レビューおよび編集 CC: 調査、AD: 形式的分析、執筆—レビューおよび編集編集、TE:調査、執筆—レビューと編集、TB:監督、方法論、データ収集、形式分析、検証、執筆—原案、執筆—レビューと編集、AK:監督、概念化、執筆—レビューと編集、プロジェクト管理、資金調達。著者全員が原稿をレビューしました。

アンドレアス・ケアーへの通信。

Andreas Kjaer は人間用の 64Cu-DOTA-TATE の発明者であり、知的財産権を保有しています。著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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Grandjean、CE、Pedersen、SF、Christensen、C. 他ウサギにおける [18F]FDG および Na[18F]F とのトランスレーショナル直接比較研究における [64Cu]Cu-DOTA-TATE によるアテローム性動脈硬化のイメージング。 Sci Rep 13、9249 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35302-5

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受信日: 2022 年 12 月 2 日

受理日: 2023 年 5 月 16 日

公開日: 2023 年 6 月 7 日

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